QUALU,UN NUEVO MÉTODO PARA DETECTAR CAMBIOS EPGÉNICOS GLOBALES EN MUESTRAS CLÍNICAS.

La epigenética estudia los cambios funcionales y estructurales del genoma que no se encuentran en la secuencia del ADN. Existen diferentes mecanismos epigenéticos, como la metilación del ADN o las modificaciones post-transcripcionales de las colas de las histonas, que colaboran en el establecimiento y mantenimiento de la arquitectura de la cromatina. Son alteraciones en estos mecanismos, junto con las ya conocidas alteraciones genéticas, las que llevan a la aparición y desarrollo de un cáncer.

De todos los mecanismos epigenéticos, la metilación del ADN (adición covalente de un grupo metilo a la citosina del dinucleótido CpG) es el más ampliamente estudiado. Por cuestiones históricas y técnicas, el incremento en CpGs metiladas o hipermetilación es la alteración más descrita en tumores, ya que está asociada a represión génica (por ejemplo de genes supresores de tumores). Sin embargo, ya en 1983 Melanie Ehrlich, Andrew P. Feinberg y Bert Vogelstein describieron la pérdida de metilación global (hipometilación) como una característica típica de los genomas tumorales. Con la pérdida de metilación, no sólo se activan oncogenes sino secuencias repetitivas (ADN satélite, transposones, etc.) que incrementan la inestabilidad cromosómica promoviendo reordenamientos cromosómicos y/o translocaciones. Asimismo, numerosas evidencias indican que existe un intercambio de información (crosstalk) entre los diferentes mecanismos epigenéticos. De esta forma, una pérdida de metilación global provoca una alteración en la estructura de la cromatina, lo que acaba traduciéndose en una expresión génica aberrante causante del fenotipo tumoral.

En los últimos años, los avances en el conocimiento de los mecanismos epigenéticos han abierto una ventana para diseñar nuevas estrategias a fin de mejorar las prácticas clínicas. En este punto, la pérdida de metilación global del ADN, como característica casi universal de las células tumorales, ha atraído un gran interés como marcador diagnóstico, pronóstico o incluso de riesgo a padecer cáncer. Es por esto que se han desarrollado numerosas técnicas con el objetivo de dar una medida cuantitativa del nivel de metilación global del genoma. No es de extrañar que muchas de estas técnicas utilicen el nivel de metilación de los transposones como indicadores de la hipometilación global, ya que, además de su naturaleza altamente repetitiva y genómicamente dispersa, son dianas de hipometilación durante el proceso tumoral. Sin embargo y a pesar de la amplia gama de técnicas, ninguna ha sido establecida en la práctica clínica debido a problemas técnicos (principalmente a la baja calidad y cantidad del ADN en las muestras de anatomía patológica), y económicos (como protocolos largos y complejos que necesitan de personal altamente cualificado y equipamientos sofisticados).

Con el objetivo de sortear los obstáculos que impiden que la hipometilación global sea una variable más a tener en cuenta en los laboratorios de anatomía patológica, hemos diseñado la técnica QUAlu (de su acrónimo en inglés Quantification of Unmethylated Alu). Como objeto de medida de la metilación global, QUAlu estima el porcentaje de secuencias Alu no metiladas en una muestra. La elección de estos transposones específicos de primates no fue casual. 

A nuestro parecer, las secuencias Alu tienen ciertas características que las hacen muy adecuadas como indicadores del nivel de hipometilación global. En primer lugar son los elementos repetitivos más abundantes del genoma humano (1.1 millones de copias por genoma haploide), en segundo lugar contienen más del 25% de los dinucleótidos CpG del genoma, y finalmente se encuentran altamente metiladas en los tejidos somáticos. Además, se localizan preferentemente en regiones ricas en genes, lo que podría tener una implicación directa en la regulación génica y por extensión en la biología tumoral.

QUAlu consiste en la digestión del ADN genómico con un par de isoesquizómeros (Hpa II/Msp I) con sensibilidad diferencial por la metilación, cuya diana (C/CGG) contiene el dinucleótido CpG susceptible de ser interrogado y está presente de manera significativa en las secuencias Alu (32.3%). Los fragmentos de restricción resultantes son ligados a un adaptador y cuantificados mediante PCR cuantitativa. QUAlu ha demostrado ser 100 veces más sensible que otras técnicas que miden hipometilación, siendo capaz de obtener determinaciones precisas de la metilación global con sólo 300 pg de ADN (equivalente a unas 50 células humanas). 

La alta especificidad de la técnica ha sido validada mediante secuenciación masiva de los productos de PCR (>97% de mapajes sobre secuencias Alu). Además, su diseño incluye controles internos de calibrado, por lo que se puede aplicar directamente en muestras de rutina patológica en las que tanto la cantidad como la calidad del ADN es muy variable. En nuestro estudio se ha aplicado QUAlu en tejido fresco, biopsias fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFEP), biopsias con punción por aspiración con aguja fina (PAAF), biopsias líquidas e incluso heces. Finalmente, cabe destacar la gran rapidez ( 5 horas) y el bajo coste económico.

Para demostrar la aplicabilidad de QUAlu realizamos un ensayo piloto en el que se utilizaron los diferentes tipos de muestras patológicas antes mencionadas y se obtuvo el porcentaje de hipometilación de tejidos normales y tumorales de diferente origen (pulmón, colon, mama, próstata y tiroides). Nuestros resultados revelan una gran homogeneidad en los niveles de metilación de los tejidos normales tanto entre tejidos como entre individuos. Por el contrario, la metilación global de las secuencias Alu es altamente variable entre los diferentes tipos tumorales, así como entre los diferentes pacientes analizados. 

Curiosamente, los cánceres menos hipometilados (tiroides, próstata y mama) se desarrollan a partir de glándulas donde la regulación hormonal juega el papel más importante, mientras que en los cánceres más hipometilados (pulmón y colon) la exposición a factores ambientales es claramente más alta. Aunque no hemos indagado en esta asociación, numerosas evidencias sostienen que ciertas drogas, químicos o contaminantes están directamente implicados en la pérdida de la regulación epigenética incluyendo la hipometilación del ADN.

En relación a esto último, hemos encontrado una asociación entre la hipometilación global de los tumores de pulmón y el tabaquismo, siendo significativamente más altos en los pacientes fumadores que en los ex fumadores y no fumadores. Finalmente, y con gran interés en el diagnóstico del cáncer de colon, hemos encontrado que en los pacientes con cáncer de colon, el nivel de hipometilación de las secuencias Alu analizadas a partir de ADN extraído de heces fue más alto que en los individuos sanos.En conclusión, QUAlu ofrece una serie de ventajas con respecto a las técnicas alternativas que la hacen especialmente sensible, específica, rápida, y económica por lo que fácilmente se podría introducir en los laboratorios de anatomía patológica. Los estudios preliminares indican su potencial aplicabilidad en oncología, aunque es necesario ampliar las series para confirmar su utilidad.

revista genética.